BRON: NMZ-bulletin, November 2003 (jaargang 14, nr. 23)
Antilichamen van lama’s, kamelen en dromedarissen bevatten antigeenbindende fragmenten die gemakkelijk te modificeren zijn. Daardoor lijken ze zeer geschikt te zijn voor pre-klininisch onderzoek en voor diagnostische en therapeutische toepassingen.
door Silvana van Koningsbruggen
(onderzoeker, Humane en Klinische Genetica,
Leids Universitair Medisch
Centrum, LEIDEN)
Veel ziekte gerelateerd genetisch onderzoek begint met het vinden van een gen defect, gevolgd door functioneel onderzoek om de expressie, de lokalisatie en de functie van het door dat gen gecodeerde eiwit te bestuderen. Antilichamen zijn hierbij van essentieel belang om de desbetreffende eiwitten (antigeen) aan te kunnen tonen. Naast het pre-klinische onderzoek, worden antilichamen ook frequent gebruikt in de diagnostiek om de aan/afwezigheid of dislokalisatie van een bepaald eiwit vast te stellen. Antilichamen zijn bovendien voor therapeutische doeleinden interessant, aangezien ze mogelijk gemuteerde eiwitten kunnen wegvangen of gebruikt kunnen worden om medicijnen naar hun werkzame plaats te brengen, zoals bij tumor-therapie.
De conventionele antilichamen, bestaande uit 2 lichte en 2 zware ketens (figuur 1A), worden meestal op een arbeidsintensieve manier uit muizen-cellijnen (hybrizoma's) gewonnen. Deze antilichamen hebben door hun grootte vaak een geringe doordringbaarheid in weefsel. Bovendien induceren ze een immuun reactie bij herhaaldelijk gebruik in patiënten. Men kan ook alleen het antigeen-bindende domein, bestaande uit VH en VL ketens (figuur 1A), isoleren en kloneren in een speciale vector (phagemide-vector). Deze verzameling antilichaam fragmenten vormen een bank, waaruit fragmenten geselecteerd kunnen worden tegen een antigeen van interesse. Het nadeel van deze techniek is dat voor functionele antilichamen er juiste combinaties van VL en VH ketens gevormd moeten worden. Veel antilichaam fragmenten zijn hierdoor instabiel of hebben een lage affiniteit voor hun antigeen.
In 1991 ontdekten Hamers-Casterman et al, dat Camelidae (lama's, kamelen en dromedarissen) naast het conventiele antilichaam repertoire (figuur 1A) ook antilichamen bevatten die uit alleen zware ketens bestaan (figuur 1B). De antigeen-bindende fragmenten van deze antilichamen (VHH fragmenten, figuur 1B) kunnen worden geďsoleerd uit enkele milliliters bloed en blijken zeer geschikt om banken van te maken, aangezien ze geen combinatie van de juiste VH en VL keten nodig hebben voor een functioneel antilichaam fragment. Verder hebben VHH fragmenten een hoge affiniteit en specificiteit voor hun antigeen, een goede doordringbaarheid doordat ze erg klein zijn en ze zijn bestand tegen extreme omstandigheden, waardoor ze ook geschikt zijn voor in vivo toepassingen. Een ander groot voordeel van VHH-fragmenten is dat ze gemakkelijk te modificeren zijn. Zo kunnen ze gefuseerd worden aan detectie of targeting signalen, dit laatste om ze naar een specifieke plaats te sturen. Bovendien is het mogelijk om VHH-fragmenten te humaniseren door delen van de Camelidae sequentie te vervangen door humane sequenties, waardoor de immunogeniciteit afneemt.
Wij maken voor ons pre-klinische onderzoek naar de mechanismen achter de ziekte oculopharyngeale spier dystrofie (OPMD) gebruik van VHH fragmenten. OPMD heeft een incidentie van 1:200.000 en wordt veroorzaakt door een mutatie in het poly-A binding protein nuclear 1 (PABPN1). Door deze mutatie hoopt het gemuteerde PABPN1 eiwit op in aggregaten in de kernen van skelet spieren. Wij hebben hoog affine VHH fragmenten tegen PABPN1 geselecteerd uit een lama bank en deze vervolgens zo aangepast dat ze gebruikt kunnen worden voor allerlei immunologische technieken. We zijn erin geslaagd om met deze antilichaam fragmenten PABPN1 heel specifiek aan te tonen in o.a. spiercoupes. In vervolg onderzoek zullen we proberen VHH fragmenten tegen het gemuteerde eiwit te selecteren, om hiermee mogelijk aggregaat vorming in vitro (en later wellicht ook in vivo) te voorkomen. De eerste stap richting klinische toepassingen voor VHH fragmenten is beschreven door Muruganandam et al (2001), waarin ze VHH fragmenten hebben geselecteerd die aan humaan cerebromicrovasculaire endotheel binden en internaliseren in vitro. Hierdoor kunnen ze mogelijk gebruikt worden om medicijnen over de bloed-hersen barričre te transporteren.
In conclusie, Camelidae VHH antilichaam fragmenten lijken dus, dankzij hun hoge affiniteit, specificiteit en doordringbaarheid, zeer geschikt te zijn voor pre-klininisch onderzoek en voor diagnostische en therapeutische toepassingen.