(geplaatst op 17 April 2001)
Overzicht van de recente internationale ontwikkelingen op het gebied van gentherapie voor Duchenne spierdystrofie. Samenvatting van mijn presentatie op de Duchenne Parent Project dag (7 Oktober 2000 te Rotterdam).
Duchenne-patiënten hebben een tekort aan het eiwit dystrofine. Dit eiwit zorgt voor de structuur en het onderhoud van spiervezels. Door het dystrofine-tekort treedt ernstige verzwakking van de spieren op. De oorzaak van het tekort is een fout in het dystrofine-gen. De laatste jaren is erg veel onderzoek gedaan aan het ontwikkelen van een genetische therapie voor deze spierziekte. Er zijn verschillende methoden onderzocht: het transplanteren van gezonde donorcellen, het introduceren van een “gezond” dystrofine-gen, of het corrigeren van de fout in het patiënt-eigen dystrofine-gen. Tijdens de presentatie op de Duchenne Parent Project dag werden deze methoden nader toegelicht.
Als één van de eerste vormen van therapie werd van celtransplantatie veel verwacht. Deze methode houdt in dat geïsoleerde en vervolgens opgekweekte spiercellen van een gezonde donor worden getransplanteerd in spieren van een Duchenne patiënt, teneinde verzwakte spiervezels te ondersteunen of zelfs nieuwe spiervezels aan te maken. De effectiviteit van deze methode is tot nu toe echter achtergebleven bij de verwachtingen, vooral omdat heel weinig cellen de transplantatie overleven. Daarbij komt dat het effect zeer lokaal is, waardoor in de praktijk vele injecties nodig zijn. Recentelijk heeft de transplantatie-methode echter weer meer aandacht gekregen door nieuwe toepassingen van beenmergtransplantatie. In beenmerg zijn zogenaamde stamcellen aanwezig. Dit zijn cellen die nog niet volledig zijn ontwikkeld en ook nog geen vaste “weefselbestemming” hebben. Recent onderzoek heeft nu aangetoond dat in Duchenne patiënten na transplantatie van beenmerg van een gezonde donor, een deel van deze stamcellen in de spieren terecht komt alwaar ze ontwikkelen tot spiercellen en dystrofine gaan maken. De eerste resultaten zijn weliswaar nog niet optimaal, maar verder onderzoek zal wellicht in de toekomst leiden tot verbetering.
Voor de introductie van een “gezond” dystrofine-gen in spieren van patiënten zijn verschillende “transportmiddelen” getest. Deze transportmiddelen, vectoren genoemd, kunnen synthetisch zijn, of gebaseerd zijn op verschillende virussen. Virussen zijn van nature namelijk zeer efficiënte “gen-overdragers”. Virale vectoren worden gemaakt door specifieke stukken van het virus-DNA middels genetische manipulatie te verwijderen. Dit voorkomt niet alleen dat het virus ziekteverwekkende eiwitten maakt, maar zorgt ook voor meer “transportruimte” voor bijvoorbeeld het lange dystrofine-gen. Adenovirale vectoren zijn de laatste jaren uitgebreid getest en aanzienlijk verbeterd als transportmiddelen voor het dystrofine-gen. Hoewel ze inmiddels veiliger zijn geworden, blijft echter een nadeel dat ze niet in staat zijn om het gen over te dragen aan volwassen spiervezels. Dit komt omdat spiervezels voor stevigheid zijn omgeven door een extra wand, de extracellulaire matrix, waar het adenovirus niet doorheen kan. Het huidige onderzoek met adenovirale vectoren voor Duchenne gentherapie is daarom gericht op verdere vector-verbeteringen om onder andere gen-overdracht in volwassen spierweefsel mogelijk te maken.
De laatste jaren zijn andere virale vectoren ontwikkeld die gebaseerd zijn op het “adeno-associated virus” (AAV). Deze vectoren zijn veelbelovend omdat AAV geen immuunreakties opwekt en dus veilig is. Bovendien is het virus zo klein dat dat wél door de extracellulaire matrix van volwassen spiervezels kan en dus heel efficiënt is in gen-overdracht naar spier. Helaas is een bijkomend nadeel van het kleine virus dat er geen ruimte is voor het lange dystrofine-gen. Dit sloot in eerste instantie AAV-vectoren uit voor Duchenne gentherapie. Echter, recent onderzoek is nu gebaseerd op het gebruik van mini-dystrofine-genen die door genetische manipulatie een stuk kleiner zijn gemaakt (maar nog steeds wel funktioneel zijn) en zodoende wel in AAV passen. Ook wordt de mogelijke toepassing van zogenaamde combinatie-vectoren getest. De eerste resultaten hiermee geven aan dat AAV-vectoren die verschillende opeenvolgende delen van het dystrofine-gen bevatten, eenmaal in de spiercellen, combinaties met elkaar kunnen aangaan die leiden tot een compleet, werkend dystrofine-gen. Omdat het optreden van deze combinaties niet heel frequent gebeurt, is het effect van deze methode op dit moment nog beperkt, maar middels genetische manipulaties zullen deze vectoren nog verder worden verbeterd.
Als alternatief voor gentherapie-methoden die gebaseerd zijn op gen-overdracht, zijn verschillende internationale groepen recentelijk begonnen met onderzoek naar de mogelijkheden van gen-correctie. Met behulp van kleine, synthetische stukjes genetisch materiaal die we oligonucleotiden (in het kort oligo’s) noemen, kunnen fouten in het dystrofine-gen worden gerepareerd (met chimere oligo’s) of gepasseerd (met antisense oligo’s). Chimere oligo’s kunnen heel specifiek een kleine fout in het gen herstellen door er aan te binden en te zorgen voor een kleine uitwisseling van genetisch materiaal. Twee verschillende amerikaanse groepen hebben afgelopen jaar aangetoond dat met zulke oligo’s, de kleine fouten in het dystrofine-gen van twee verschillende diermodellen voor Duchenne spierdystrofie (de mdx-muis en de GRMD-hond) kunnen worden hersteld. Dit is veelbelovend, aangezien een dusdanige gen-correctie permanent is. Belangrijke nadelen van deze methode zijn echter dat alleen kleine foutjes in het gen kunnen worden gerepareerd (terwijl in de meerderheid van DMD-patiënten grote stukken van het gen ontbreken) en dat het effekt van deze methode matig is: na injectie in de spier krijgen lang niet alle cellen zo’n oligo daadwerkelijk binnen en in de cellen die de oligo hebben gekregen, vindt de gen-correctie alleen met lage frequenties plaats.
Bij de afdeling Humane Genetica van het Leids Universitair Medisch Centrum in Leiden wordt thans gewerkt aan het ontwikkelen van een methode die gericht is op gen-correctie met behulp van antisense oligo’s. Deze oligo’s kunnen een bepaald fout-bevattend deel van het dystrofine-gen afschermen waardoor dit gedeelte in de uiteindelijke genetische code wordt overgeslagen.
Het dystrofine-gen heeft 79 bouwstenen, exonen genoemd, welke samen de genetische code voor het dystrofine-eiwit vormen. In veel Duchenne patiënten ontbreken één of meerdere van deze exonen waardoor de code is verstoord en er geen eiwit kan worden gemaakt. Eén van de meest voorkomende fouten in het dystrofine-gen is het ontbreken van exon 45. Duchenne patiënten met deze fout hebben een tekort aan dystrofine, omdat exon 44 vast zit aan exon 46 en zo de genetische code is onderbroken. Er zijn echter ook Becker spierdystrofie patiënten met een dystrofine-gen waarin zowel exon 45 als exon 46 ontbreken. Toch hebben deze patiënten een veel milder ziektebeeld. Dit komt omdat in hun dystrofine-genen exon 44 vast zit aan exon 47 hetgeen de genetische code niet onderbreekt. Daarom wordt er in deze patiënten weliswaar een korter, maar waarschijnlijk grotendeels functioneel dystrofine-eiwit gemaakt.
Hierop gebaseerd, wordt er nu in Leiden een methode ontwikkeld om in Duchenne patiënten met een dystrofine-gen waarin exon 45 ontbreekt, ook exon 46 te verwijderen uit de genetische code. We noemen dit exon skipping. Exon skipping doen we met behulp van antisense oligo’s die dusdanig binden aan exon 46 dat dit exon is afgeschermd en zo wordt overgeslagen tijdens het verwerken van de genetische code. We hebben dit getest in gekweekte spiercellen van twee verschillende Duchenne patiënten met die specifieke fout in hun dystrofine-gen. Na behandeling van de spiercellen met de antisense oligo’s waren we in staat om in 80% van de cellen de genetische code te herstellen (vergelijkbaar aan de code in Becker patiënten met een dystrofine-gen waarin zowel exon 45 als exon 46 ontbreken). Door dit herstel van de code gingen de behandelde spiercellen het verkorte dystrofine-eiwit maken. Eiwitkleuringen toonden aan dat dit verkorte eiwit terecht komt in de wand van de spiervezels, hetgeen betekent dat zo’n eiwit zonder exon 45 en 46 naar alle waarschijnlijkheid wel funktioneel kan zijn. Hoewel nog veel onderzoek zal moeten worden gedaan om de specificiteit en uiteindelijke toepasbaarheid van deze methode te testen, zijn de eerste resultaten met de antisense oligo’s dus uiterst bemoedigend. Het huidige onderzoek is nu gericht op de toepassing ervan in spieren van muizen. De grootste hindernis die namelijk nog zal moeten worden genomen, is het ontwikkelen van een techniek voor het efficiënte transport van de oligo’s door het spierweefsel.
(voor details over dit onderzoek, volg de links vanuit onze onderzoeksgroep "Genome Technology and Genetic Disease")